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1.葉綠素熒光測量有哪些主要技術？有沒有哪種儀器可以同時實現這些測量技術？

答：葉綠素熒光技術有三種主要測量技術路線：

1)PAM脈沖調制式葉綠素熒光技術：測量PAM熒光淬滅動力學曲線

2)直接激發(fā)式（非調制式）葉綠素熒光技術：測量OJIP快速熒光誘導曲線

3)雙調制式葉綠素熒光技術：時間分辨率可以達到1微秒，用于測量QA-再氧化動力學曲線、S-state、單周轉或多周轉飽和光閃快速熒光動力學等

4)其它葉綠素熒光測量技術：如激光誘導（LIF）葉綠素熒光測量、太陽光誘導葉綠素熒光（Solar-induced Chlorophyll Fluorescence，SIF）測量等（參見本條后面介紹） 

目前，能夠同時完成上述1）至3）三種熒光動力學曲線測量的儀器只有FL6000雙調制葉綠素熒光儀、 FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)和FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)。而由于OJIP快速熒光動力學曲線和QA-再氧化動力學曲線對技術的特殊要求，對這兩種曲線的成像分析更是只有FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)和FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)能夠實現。

左圖： FL6000雙調制葉綠素熒光儀；中圖：FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)；右圖：FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)

超積累植物鼠耳芥在Cd/Zn處理后的OJIP成像圖與OJIP動力學曲線（Morina, 2020）

超積累植物鼠耳芥在Cd/Zn處理后的PAM熒光淬滅顯微成像圖與QA-再氧化動力學分析（Morina, 2020）

易科泰生態(tài)技術公司提供葉綠素熒光技術全面解決方案，除傳統(tǒng)的PAM技術、OJIP測量技術、雙調制技術外，還提供葉綠素熒光高光譜成像和激光誘導（LIF）葉綠素熒光高光譜成像技術方案，不僅可以解析植物葉綠素熒光二維異質性分布，還進一步從高光譜緯度解析葉綠素熒光光譜特性，并成像分析Fr（葉綠素熒光紅色峰值）、Ffr（葉綠素熒光遠紅峰值）、Fr/Ffr、F735/F700（與葉綠素濃度呈直線相關）及基于葉綠素熒光不同峰值（紅色峰值Fr和遠紅峰值Ffr等）的葉綠素熒光參數。LIF葉綠素熒光高光譜成像技術可實現大田葉綠素熒光近地遙感測量。

左圖：葉綠素熒光參數Fr/Ffr成像；右圖：葉綠素熒光光譜（易科泰光譜成像與無人機遙感研究中心提供）

2.測量葉綠素熒光的光源為什么最好具備兩種以上顏色？什么顏色的光源最好？

答：在FluorCam葉綠素熒光成像系統(tǒng)中一般推薦的光源組成是這樣的：

5)測量光：紅光

6)光化光：紅光+白光或紅光+藍光

7)飽和脈沖光：白光或藍光

在脈沖調制技術中，測量光最主要的作用是測量最小熒光F0。而在激發(fā)F0時，要求光反應中心不產生電荷分離和熱耗散。在激發(fā)葉綠素熒光的可見光波段中，紅光波長最長，能級最低，能夠確保葉綠素分子被激發(fā)到較低的激發(fā)態(tài)。而藍光等波長較短的光在激發(fā)葉綠素熒光時則可能造成熱耗散。因此紅光最佳的熒光測量光源。

左：熒光淬滅測量過程中qN與qP的變化；右：紅光和藍光激發(fā)葉綠素熒光的差別

在光化光和飽和光的選擇上，則主要考慮熒光激發(fā)效率問題，這與植物/藻類樣品中光合色素的吸收光譜是密切相關的。如下圖可見，紅光和藍光對應葉綠素吸收峰，激發(fā)葉綠素熒光效率最高，也可用于研究植物/藻類對不同光質的響應。白光是連續(xù)光譜，可模擬自然光，同時兼顧各種光合色素。紅光能級較低，一般不推薦作為飽和脈沖光源。FluorCam也可定制其他波段光源針對特定樣品，尤其是藻類樣品，比如590 nm琥珀光、530nm青光、505nm綠光等。

兩種或兩種以上光化學光的另一個優(yōu)勢是，可進行不同光質光和效率研究及光生物學研究，如下圖所示（引自Sander W. Hogewoning等，Blue light dose-responses of leaf photosynthesis, morphology, and chemical composition of Cucumis sativus grown under different conbinations of red and blute light. Journal of Experimental Botany, 2010）

3.FluorCam有哪些PAM脈沖調制測量功能與參數？

答：FluorCam主要的PAM脈沖調制測量功能和獲得的參數如下：

• ?Fv/Fm：測量參數包括F0，Fm，Fv，Fv/ Fm等

• ?Kautsky誘導效應：F0，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd等熒光參數

• ?熒光淬滅分析：F0，Fm，Fp，Fs，Fv，Fv/ Fm，QY，F0’，Fm’，Fv’/ Fm’，NPQ，qP，Rfd，qN，qL等

• ?光響應曲線：F0，Fm，Fv/ Fm，不同光強下QY，Fv’/ Fm’，NPQ，qP，ETR等

具體參數可參閱下表：

參數符號概念描述

4.主要葉綠素熒光參數的值域范圍是多少？相互關系是怎么樣的？

答：一般來說，Fm ≥ Fp ≥ Ft ≥ Fs ≥ Fo，Fo’ ≥ Fo，Fm’ ≤ Fm，暗弛豫（actinic light關閉后）的Fm ≤ 暗適應的Fm，Fp和Fm’沒有嚴格高低關系。

最大光化學效率Fv/Fm或QYmax值域0 – 1。但實際上，在理想狀況下存在上限。：

• ?C3植物：0.83 - 0.84                                 (Bjorkman and Demmig 1987) 

• ?C4植物：0.78                                                 (Pfundel 1998)

• ?藻類：常低于0.7                                         (Trissl and Wilhelm 1993)

這一上限在不同文獻中存在差異，但一般來說，C3植物在實驗中對照組數據要爭取大于0.8，最高不能高于0.86。

實際光化學量子效率或量子產額QY或ΦPSII值域0 ? 1，≤ Fv/Fm，一般隨Actinic light升高而降低。

Rfd值域為0 ? ∞ ，一般在0 – 6。

qN、 qP、 qL值域為0 – 1。

NPQ值域為0 ? ∞，一般在0 – 4。因此，有的文獻中會使用NPQ/4這一參數來對其歸一化。

5.FluorCam軟件中的熒光參數似乎與文獻中的有些差異，一般文獻中使用的參數對應FluorCam軟件中的哪個參數？

答：軟件中為了便于識別與區(qū)分，與文獻中的一般描述有所差異。一般文獻中提到的參數在FluorCam軟件中的顯示如下：

文獻中的參數FluorCam軟件中的參數

軟件參數后綴L代表光適應過程，D代表暗弛豫過程， ss為steady-state縮寫，代表穩(wěn)態(tài)。Lss即為光穩(wěn)態(tài)。

對于光適應條件下的熒光參數，文獻中都默認使用的是光穩(wěn)態(tài)時的對應參數。FluorCam軟件中特別以Lss后綴加以區(qū)分。而其他的L1、L2、D1、D2等對應的參數則可以表征表示光適應或暗弛豫從起始到穩(wěn)態(tài)的變化過程。

在光響應曲線Light Curve測量中，由于每一個光強梯度均達到光穩(wěn)態(tài)，因此參數后綴均為Lss，不同數字表示不同的光強梯度。

QY在中英文文獻中可能會有多種不同的表述方法，但實際上其代表的意義是相同的，即光適應下的真實光能轉化效率，計算公式也是相同的。 

6.光適應下的最小熒光F0’是如何測量的？

答：最小熒光 F0是在暗適應條件下測量得到的，這時PSII光反應中心處于完全開放狀態(tài)（qP=1）。而在光適應下PSII光反應中心處于部分關閉的狀態(tài)（0＜qP＜1），這時候怎么可能測量最小熒光呢？

以前，由于技術限制，所有葉綠素熒光儀器都不能直接測量F0’。1997年，Oxborough和Baker提出了一個F0’的估算公式：

之后的一系列研究證明，這個公式估算得到的數據是可信的。即使是現在，大部分沒有明確說明的葉綠素熒光儀器依然是使用這個公式進行估算。

但這個數據終究不是直接測量得到的，在很多光合研究中是無法代表。隨著LED技術的進步，FluorCam則通過配備專用的遠紅光源板來對F0’進行實測。這是利用了遠紅光只會激發(fā)PSI而不激發(fā)PSII的特性。在光適應剛剛結束，光化光關閉時，立刻照射遠紅光，使PQ庫氧化，強制PSII達到完全開放的狀態(tài)，從而對F0’進行實測。

從另外一個方面說，沒有配備遠紅光源的葉綠素熒光儀或者熒光成像儀都是不能實際測量F0’的。同時，有些熒光成像儀即使配備了遠紅光源，但由于其遠紅光源沒有與PAM脈沖調制測量程序聯動，也不能實際測量F0’。

7.葉綠素熒光測量前為何要進行暗適應？必須要進行暗適應嗎？

答：暗適應是為了測最大熒光Fm和最小熒光Fo。

植物/藻類在經過一定的暗適應后，QA最大程度被氧化，光反應中心完全“開放”，此時儀器運行程序則自動發(fā)出測量光，才以測得最小熒光F0。此測量光極小，不能引起光化學反應。也可不進行暗適應直接測量，運行Fv/Fm程序，測量得到的QYmax=QY（實際光量子效率）。

8.已經有葉綠素熒光儀了，是否還有必要買葉綠素熒光成像儀？

答：有必要。葉綠素熒光儀為點測量，獲得眾多熒光參數值，單次測量難以反映樣品的整體特性，可多次測量取平均值等。比起熒光儀，葉綠素熒光成像儀有以下不可替代的優(yōu)點：

?數據結果可以是整個樣品的平均值，可反映樣品的整體特性，避免樣品差異造成的誤差；也可以通過ROI選區(qū)工具自動或手動選擇不同區(qū)域進行分析

?成像圖能夠全面反映整株植物、葉片、藻類群體等的不同位置熒光強度變化與分布，即光合作用生理生態(tài)及脅迫的異質性分布狀態(tài)。

?可測量葉片、果實、麥穗、大型藻/微藻、整株植物乃至植物冠層等各種樣品。

?可同時測定幾十、甚至上百株個樣品。

?能夠在顯微水平研究葉綠體或藻類細胞。

?尤其適用于環(huán)境脅迫早期植物不同部位光合活性的變化規(guī)律、突變體不同部位的光合功能差異等研究。      

9.葉綠素熒光測量時如何選擇光質？

答：葉綠素熒光測量主要針對葉綠素a，葉綠素a的兩個光譜吸收波峰在藍紫光波段和紅光波段，因此選擇藍光、紅光或者白光（復合光）一般均可。其中注意，藍藻測量時盡量選擇紅光。

10.葉綠素熒光測量必須在植物活體上測量嗎？

答：原則上，葉綠素熒光測量因盡量對樣品活體原位檢測。條件不允許時可以測量離體葉片，但盡量在活體狀態(tài)下進行暗適應處理，測試時離體時間不超過15-20分鐘。但具體情況也要看樣品在離體后失水影響的具體情況，有些樣品則在短時離體后就會萎蔫卷曲，如水稻，而有些樣品可耐受長時間離體，如一些革質葉片。離體檢測盡量使用濕紗布等包裹葉梗，如需光下轉運可使用兩片濕濾紙夾住葉片，避免葉片失水，影響測量結果。

11.NPQ為負值應當如何解決？

答：一般是測量參數設置不當造成的，可嘗試將飽和脈沖光適當調大或光化光適當調小。有些是樣品特性造成的，這種情況可嘗試更換光質。

12.是否能獲得ETR？如何獲得ETRmax？

答：葉綠素熒光測量儀運行LC1~3程序，葉綠素熒光成像運行LightCurve程序，均可獲得ETR。ETRmax則需使用sigma plot等工具軟件，擬合光響應曲線RLC來獲得。（參考文獻：Ralph P J, Gademann R. Rapid light curves: A powerful tool to assess photosynthetic activity[J]. Aquatic Botany, 2005,82(3):222-237. 更多參考文獻可聯系易科泰獲?。?/span>

13.葉綠素熒光成像時對樣品有何要求？

答：要求樣品無任何遮擋，盡量平鋪，整株植物成像則最好對同一水平高度的部分進行檢測。大型藻可有水濕潤但水不要沒過樣品。背景盡量單純并且為黑色或者非反光材質。避免使用錫紙、塑料板等反光物品。測量時一般選用葉片正面，而當葉片背面首先遭受病蟲害時，則也可對背面進行檢測。

14.我的不同處理組樣品是分開成像的，那在寫論文時如何將圖片放在一起對比？

答：屬于同一實驗且需要保存的成像圖，必須將其彩色標尺調整為相同的區(qū)間。具體步驟如下：

1）點選軟件result界面右下方Group color前√ ，同一類參數將使用同一彩色標尺。

2）點選右下方Manual color前√ ，手動設定標尺范圍，右鍵保存成像圖。

3）不同處理樣品重復以上步驟，所有樣品同一參數的成圖像標尺范圍必須設定一致。

4）設定標尺范圍的標準：符合對應參數的理論范圍，比如Fv/Fm、QY不超過0-1，NPQ一般不超過0-4等；為了突出成像效果，可縮小標尺范圍，但要確保成像圖上主要的像素點在這一范圍內

15.可以通過FluorCam評估葉綠素濃度嗎？

答：有三種方法可以評估葉綠素濃度：

1）最小熒光F0、最大熒光Fm和OJIP快速熒光參數Area都與葉綠素濃度有正相關性，有很多相關的文獻進行過探討（Chen，2021，2017）。但由于葉綠素熒光參數同時與光合狀態(tài)有關，因此在使用上應小心。

2）通過PAR吸收模塊實現。通過這個模塊測量計算的NDVI植被歸一化指數，與葉綠素濃度成正相關，這一參數本身就廣泛用于大田遙感普查、森林生態(tài)監(jiān)測等。同時成像圖能夠反映葉綠素濃度異質性。

3）通過紫外激發(fā)多光譜熒光成像實現。測量的F690/F740與葉綠素濃度為負相關。目前已有研究其用于作物氮素營養(yǎng)狀況評估。

浙江大學應用FluorCam多光譜熒光成像技術進行油菜氮素營養(yǎng)快速評估（Sun，2020）

16.在使用FluorCam軟件導出數據時，使用Frame numeric還是 numeric average更好？

答：通常，我們建議使用numeric average。以計算Fv/Fm為例，Frame numeric是指先計算每個像素的Fv/Fm，然后再除以像素數求得區(qū)域平均Fv/Fm。而numeric average，則是先獲得整個區(qū)域的平均F0、平均Fm，再以此計算Fv/Fm。如果分析過程中，樣本信號強，噪點很少，兩種方式的差異不明顯。如果樣本熒光信號弱，并且存在噪點，則選擇numeric average更好。

17.FluorCam顯示pixels overflow是什么意思？對數據有何影響？怎么修正？

答：高靈敏度CCD相機檢測熒光的范圍為0-4096個單位，高分辨率CCD相機則在0-65536。超出該信號就會警示pixels overflow即信號溢出。在開始實驗測量前，您需要在live窗口調整shutter和sensitivity，以及設置適合的光強。在打開flash情況下調整shutter和sensitivity使暗適應后的樣品熒光值處于較低數值（此時顯示的熒光值其實F0）。我們通常建議高靈敏度CCD相機設置到500-1000，高分辨率CCD相機設置到5000-10000。不同的植物需要不同的設置，建議預實驗摸索。

18.Shutter和sensitivity如何影響成像質量？為了獲得最佳效果，建議哪些組合設置？

答：詳細的設置方法參考說明書。簡短來說，shutter即快門時間，同時還控制測量光的持續(xù)時間，一般不超過20或30ms ，sensitivity即靈敏度。兩者越高，熒光信號值越高，太高則超出正常F0的范圍。Shutter一般建議設置10-20us，最大不超過33us。Sensitivity越高信噪比越低，建議一般不超過50％。

19.鹽脅迫水稻幼苗非光化學熒光淬滅成像：視頻中動力學曲線隨著脅迫加重而上升說明了什么，還有怎么去分析此類型的動力學曲線？

答：動力學曲線隨脅迫加重上升一般是因為脅迫導致PSII光化學反應活性降低，光能轉化效率低，更多的光能以熒光的形式散失，所以導致熒光信號增強。

熒光動力學曲線的分析通常有兩種方式：一是比較不同樣品在暗適應-光適應-暗弛豫3個階段的熒光強度變化的差異，考察PSII對光強變化的適應性和可塑性以及每個階段的PSII的活性及電子傳遞狀況。分析結果都是定性描述，定量分析仍需借助計算值；另外一種分析方式是將動力學曲線上的特征性熒光強度（如Fm_Ln，n代表第幾次脈沖）作為變量，和計算值（如Fv/Fm）一起輸入到數學模型中，從而篩選出能夠反映脅迫程度的特征參數。后者可參考以下論文：

龍燕, 馬敏娟, 王英允,等. 利用葉綠素熒光動力學參數識別苗期番茄干旱脅迫狀態(tài)[J]. 農業(yè)工程學報, 2021, 37(11):8.

20.葉綠素熒光測量技術與光合儀的區(qū)別？

答：兩者都是研究植物和藻類光合作用的有效工具，但是側重不同。

光合儀主要測量植物的宏觀參數，如光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、胞間CO2濃度等，以評估衡量植物光合作用的強度和能力，并標配或可選配微氣候控制如光、溫、濕、CO2模塊。

葉綠素熒光不僅能反映光能吸收、激發(fā)能傳遞和光化學反應等光合作用的原初反應過程，而且與電子傳遞、質子梯度的建立及ATP合成和CO2固定等過程有關，是研究植物光合作用的“探針”。

兩者結合測量在植物光合生理研究中可以有效互補，可廣泛應用于衡量植物生長狀況，不同脅迫處理對植物光系統(tǒng)的影響，評價生態(tài)系統(tǒng)碳收支與全球氣候變化的相互關系，植物光系統(tǒng)對全球變化響應等方面。

21.藍藻光合參數的測定

答：由于藍光無法激發(fā)藍藻PSII主要的天線色素藻膽素，只能激發(fā)葉綠素，而藍藻中PSI中的葉綠素要多于PSII，這會使PQ庫部分氧化，所以需要選擇藍光以外的激發(fā)光源，如UV365nm、cyan470nm、green530nm、orange625nn。